一、食品安全与检疫中微生物检测的现状

在食品安全与检疫领域，众多微生物对人体健康和食品质量构成严重威胁。

沙门氏菌是常见的食源性致病菌，其血清型超过2500种，部分能导致人类肠热症。据统计，在全球各类细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引发的案例常居首位。2023 年美国东北部发生的牛肉末污染事件，致使至少16人感染，6人住院治疗；2024 年苏州的食物中毒事件，也是因人员食用了被沙门氏菌污染的食物，在晚宴后出现腹泻等症状。人体感染沙门氏菌后，通常会出现发热、恶心、呕吐、腹泻等症状，幼儿、老年人及免疫力低下人群感染后，病菌可能进入血液，引发菌血症，少数人还会合并脑膜炎或骨髓炎，严重时可危及生命。

李斯特菌也是不容忽视的食源性致病菌，主要通过污染的食物传播，常见于未经充分加热的熟食、生食和一些奶制品中。虽然李斯特菌症可影响任何人，但婴儿、老年人、孕妇及其新生儿以及免疫系统受损的人群更容易受到严重感染。孕妇一旦感染李斯特菌，可能导致流产、早产或新生儿严重感染；对于一般成年人和儿童，感染后可能表现为轻微的流感样症状，如发热、肌肉痛、恶心和腹泻；而免疫系统受损的人群，感染后可能引发更严重的症状，如脑膜炎（表现为头痛、颈部僵硬、混乱、耐光性、发烧等）和败血症。

二、博清生物荧光定量PCR仪在微生物快速检测中的应用实例

（一）检测流程

1、样本采集：根据不同的食品类型，采用合适的采样方法。对于肉类，使用无菌刀具在肉块不同部位采集适量组织，将采集的样本迅速放入无菌采样袋中，并做好标记；乳制品则可直接用无菌吸管吸取适量液体装入无菌采样瓶；果蔬需用无菌纱布擦拭表面后，用无菌打孔器在表皮和内部组织分别采集多个样本，混合后放入无菌容器。采集过程需严格遵守无菌操作原则，避免外界微生物污染样本，影响检测结果的准确性。同时，采样数量应根据检测要求和统计学原理确定，以保证样本的代表性。

2、核酸提取：采用磁珠法进行核酸提取，该方法利用表面修饰的磁性微珠和核酸结合，通过磁场分离核酸和杂质，最后洗脱核酸。首先将采集的样本加入裂解液和蛋白酶K，在60℃条件下孵育15分钟，以充分破坏细胞或病毒，释放核酸。然后加入磁珠悬浮液，轻轻混匀，在室温下孵育5分钟，使磁珠与核酸充分结合 。接着将反应管置于磁力架上，待磁珠吸附在管壁后，小心吸弃上清液。用洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，每次洗涤后都要充分混匀并短暂离心，再置于磁力架上吸弃上清液，以去除蛋白质、盐类、有机溶剂等杂质。最后用低盐缓冲液（如ddH₂O或TE）洗脱核酸，得到纯净的DNA或RNA，将提取的核酸保存于-20℃冰箱中备用。

3、PCR扩增：在进行PCR扩增前，需准备好反应体系。根据实验需求，准备引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs等试剂。引物和探针的设计应具有高度特异性，针对目标微生物的保守基因序列进行设计，以确保能够准确检测到目标微生物。例如，检测大肠杆菌O157:H7时，可选择其特异性的志贺毒素基因（stx）作为靶基因设计引物和探针。将处理好的样本核酸和试剂按一定比例加入到PCR反应管中，总体积一般为20-25μl。反应体系中各成分的浓度需经过优化，以保证扩增效果。将PCR反应管放入博清生物荧光定量PCR仪中，设置合适的反应程序。一般先进行预变性，在95℃下保温10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，并使模板DNA充分变性；然后进入循环阶段，进行40次循环，每个循环包括95℃变性15秒、60℃退火和延伸60秒；最后进行熔解曲线分析，从75℃逐渐升温至95℃，每20秒升温1℃，同时监测荧光信号的变化。在仪器运行过程中，要密切关注仪器的状态和荧光信号的变化情况，确保扩增反应正常进行。

4、结果分析：实验结束后，仪器自动生成结果，包括扩增曲线和Ct值等。扩增曲线是以荧光信号强度为纵坐标，循环数为横坐标绘制的曲线，理想的扩增曲线应呈现出典型的S型，即起始阶段荧光信号较弱，随着循环数的增加，荧光信号逐渐增强，进入指数增长期，最后达到平台期。Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，Ct值与模板起始浓度呈负相关，即模板起始浓度越高，Ct值越小。通过与标准曲线对比，可以确定样本中目标微生物的含量。标准曲线是用一系列已知浓度的标准品进行PCR扩增，以标准品的初始模板浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制而成。使用配套的软件对结果进行分析和处理，根据实验目的进行数据统计、比较和判断。如果样本的Ct值在标准曲线的线性范围内，可根据标准曲线计算出样本中目标微生物的含量；若Ct值大于设定的阈值或未出现明显的扩增曲线，则判定为阴性结果，表明样本中未检测到目标微生物或微生物含量低于检测限。同时，还需对结果进行质量控制，例如设置无模板对照（NTC）和阳性对照，无模板对照应无扩增曲线或Ct值大于设定阈值，以确保反应体系无污染；阳性对照应出现典型的扩增曲线且Ct值在预期范围内，以验证实验的有效性。

（二）实际案例分析

1、肉类检测：在某肉类加工企业的日常检测中，采用博清生物荧光定量PCR仪对一批猪肉原料进行沙门氏菌检测。同时，用传统培养法作为对照 。传统培养法按照国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行，首先将样品进行前增菌和选择性增菌，然后进行分离培养、生化鉴定和血清学鉴定，整个过程耗时约4-5天。而使用博清生物荧光定量PCR仪检测时，从样本采集到得到检测结果仅需3-4小时。在检测的100份猪肉样本中，传统培养法检测出5份阳性样本，博清生物荧光定量PCR仪检测出6份阳性样本。进一步对这6份样本进行复核，发现其中1份样本的微生物含量极低，传统培养法因灵敏度不足而漏检。这表明博清生物荧光定量PCR仪在检测速度上具有显著优势，能够快速判断肉类原料是否受到沙门氏菌污染，及时采取措施，避免受污染的产品进入后续加工环节；同时，其灵敏度更高，能够检测出低浓度的微生物污染，有效保障肉类产品的安全。

2、乳制品检测：某乳制品生产企业怀疑一批牛奶受到大肠杆菌污染，分别使用博清生物荧光定量PCR仪和常规PCR法进行检测。常规PCR法检测流程包括样本处理、PCR扩增、电泳检测等步骤，整个检测过程需要约6-8小时 。博清生物荧光定量PCR仪检测同样从样本采集开始，经核酸提取、PCR扩增到结果分析，全程仅需3-5小时。对100份牛奶样本检测后，常规PCR法检测出8份阳性样本，博清生物荧光定量PCR仪检测出9份阳性样本。对差异样本进行测序验证，结果显示博清生物荧光定量PCR仪检测出的那份额外阳性样本确实含有大肠杆菌，常规PCR法因电泳检测的局限性，未能准确分辨出该样本中的微量大肠杆菌。这充分体现了博清生物荧光定量PCR仪不仅检测速度快，而且在准确性上也更胜一筹，能够更精准地检测出乳制品中的大肠杆菌污染，为乳制品生产企业的质量控制提供有力支持。

3、果蔬检测：在对一批进口草莓进行李斯特菌检测时，对比了博清生物荧光定量PCR仪和传统检测方法。传统检测方法包括样本增菌、分离培养、生化鉴定等，整个流程需要5-7天 。博清生物荧光定量PCR仪检测从采样到出结果仅需4-6小时 。检测的80份草莓样本中，传统方法检测出3份阳性样本，博清生物荧光定量PCR仪检测出4份阳性样本。经进一步检测确认，博清生物荧光定量PCR仪检测出的那份多出来的阳性样本中确实存在李斯特菌，只是含量较低，传统方法由于检测周期长、灵敏度有限，未能及时发现。这再次证明了博清生物荧光定量PCR仪在果蔬检测中的优势，能够快速、准确地检测出李斯特菌，防止受污染的果蔬流入市场，保障消费者的健康。

三、应用前景与展望

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在食品安全与检疫领域展现出广阔的应用前景。随着人们对食品安全重视程度的不断提高，以及相关法规标准的日益严格，对快速、准确的微生物检测技术的需求持续增长。博清生物荧光定量PCR仪凭借其卓越的性能，能够满足这一需求，在食品生产企业、监管部门、第三方检测机构等得到更广泛的应用。在食品生产企业中，可用于原材料和成品的日常检测，及时发现微生物污染，避免不合格产品流入市场，保障企业的声誉和消费者的健康。监管部门利用该仪器，能更高效地对市场上的食品进行抽检，加强食品安全监管力度，维护市场秩序。第三方检测机构借助其优势，为客户提供更优质、快速的检测服务，增强市场竞争力。

从技术发展方向来看，未来博清生物荧光定量PCR仪可能会朝着更高通量、更小型化和自动化的方向发展。高通量检测能够一次处理更多的样本，进一步提高检测效率，满足大规模检测的需求。例如，开发更高孔数的反应板，如384孔板，可同时对更多样本进行检测，在应对突发食品安全事件时，能够快速对大量样本进行筛查。小型化则使仪器便于携带，可用于现场检测，如在农产品种植基地、食品加工车间、农贸市场等场所，及时对食品进行检测，减少样本运输和保存过程中的风险。自动化程度的提高，可实现从样本处理到结果分析的全流程自动化，减少人工操作误差，提高检测的准确性和重复性，同时也能降低对专业技术人员的依赖，使检测工作更加便捷高效。

在应用拓展方面，除了现有的微生物检测，博清生物荧光定量PCR仪还有望在转基因食品检测、食品溯源等领域发挥重要作用。随着转基因技术在农业中的广泛应用，转基因食品的安全性和标识问题备受关注。荧光定量PCR仪能够准确检测食品中的转基因成分，并对其含量进行定量分析，为监管部门和消费者提供重要信息。在食品溯源方面，通过检测食品中的微生物DNA或其他特征性核酸序列，结合大数据和区块链技术，可建立食品从生产到销售的全链条溯源体系，一旦发生食品安全问题，能够快速准确地追溯到问题源头，采取相应措施，降低食品安全风险。

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪作为一种先进的检测设备，在食品安全与检疫领域具有重要的应用价值和广阔的发展前景。随着技术的不断进步和应用的不断拓展，它将为保障食品安全、维护公众健康做出更大的贡献。

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在食品安全与检疫的微生物快速检测中具有不可替代的重要作用。面对常见且危害巨大的食源性致病菌，如沙门氏菌、大肠杆菌和李斯特菌等，传统检测方法存在诸多局限性，而博清生物荧光定量PCR仪基于先进的技术原理，具备准确性高、灵敏度高、速度快和特异性强等显著特点。

通过肉类、乳制品和果蔬检测等实际案例分析，充分验证了其在缩短检测时间、提高检测准确性和灵敏度方面的优势，能够及时发现低浓度微生物污染，有效避免受污染食品流入市场，保障消费者健康。与其他品牌荧光定量PCR仪相比，博清生物产品在准确性、灵敏度、检测速度、价格以及售后服务等方面均展现出明显的竞争优势。

展望未来，随着人们对食品安全重视程度的不断提升以及相关法规标准的日益严格，博清生物荧光定量PCR仪有望在食品生产企业、监管部门、第三方检测机构等得到更广泛的应用。同时，其在技术上朝着更高通量、更小型化和自动化方向发展，在应用领域向转基因食品检测、食品溯源等方向拓展，将为食品安全与检疫工作提供更强大的技术支持，对保障食品安全和公共健康具有极其重要的意义。